Radiation dose determines the method for quantification of DNA double strand breaks

RESUMO

A radiação ionizante induz a rupturas dos filamentos duplos (DSBs) do DNA que ativam a fosforilação da proteína histona H2AX (γH2AX). A coloração por imunofluorescência visualiza a formação de focos de γH2AX, permitindo a sua quantificação. Esse método, em oposição ao ensaio de Western blot e citometria de fluxo, fornece uma análise mais precisa demonstrando a posição exata e a intensidade de sinal fluorescente em cada célula individualizada. Na prática, existem problemas na quantificação de γH2AX. Esta pesquisa se baseia em duas questões: a determinação de qual técnica deve ser aplicada, relativa à dose de radiação, e como analisar imagens de microscopia fluorescente obtidas por diferentes microscópios. Células de melanoma HTB140 foram expostas a raios-y, com doses na faixa de 1 a 16 Gy. Efeitos das radiações a nível de DNA foram avaliadas em diferentes intervalos de tempo e após a irradiação analisada por Western blot e pela microscopia de imunofluorescência. Células coradas imunoquimicamente foram visualizadas por dois tipos de microscópios: microscópio AxioVision (Zeiss, Alemanha), que compreendem com software ApoTome, e o microscópio AxioImagerA1 (Zeiss, Alemanha). Os resultados obtidos mostram que o nível de γH2AX é tempo e dose dependente. Microscopia de imunofluorescência forneceu uma melhor detecção de DSBs para doses de radiações mais baixas, enquanto a análise Western blot foi mais confiável para doses de radiações mais elevadas. Microscópio AxioVision contendo o software ApoTome foi mais adequado para a detecção de focos γH2AX.

Palavras-chave: software ApoTome; microscópio Axio­ImagerA1; microscopia de imunofluorescência; Western blot; γH2AX